La síntesis del genoma real se realizó utilizando un conjunto de tecnologías que ensamblan secuencias de ADN cortas desde cero o combinan muchas secuencias más cortas en una sola secuencia más grande. De principio a fin:
- Síntesis de oligonucleótidos y ensamblaje de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para construir fragmentos de longitud 1.4 kbp. (Profundizar en el suplemento revela que escribieron su código de diseño oligo en macros de WordPerfect, de todas las cosas).
- Ensamblaje Gibson (un protocolo desarrollado por JCVI que se ha vuelto bastante estándar) de 5 fragmentos de 1,4 kbp + vector y transformación en E. coli (es decir, 7 kbp). Hicieron una secuenciación de alto rendimiento (Illumina MiSeq) en este punto para verificar que tenían las construcciones deseadas.
- Ensamblaje de levadura de hasta 15 fragmentos a la vez para generar genomas de “un octavo”. Cuando la levadura se co-transforma con fragmentos de ADN que tienen una secuencia superpuesta en los extremos, los ensamblan de manera bastante eficiente en construcciones individuales. Esta técnica permite ensamblajes muy grandes: JCVI ha ensamblado previamente un genoma de 590 kb de 25 fragmentos en un solo paso. Los genomas “un octavo” también se ensamblaron en genomas completos mediante este método, y la secuenciación de lectura larga de PacBio se usó para verificar los genomas finales.
- Trasplante de genoma usando una modificación del método que han usado en el pasado.
Según el documento, pueden hacer todo esto en tres semanas, con la ayuda de una gran cantidad de manejo automatizado de líquidos. Los oligos se ordenan a IDT, no se hacen internamente.
JCVI utilizó métodos similares en sus documentos de 2008 y 2010, y aparentemente los han estado optimizando desde entonces. Ninguna de estas técnicas es individualmente especialmente novedosa (aunque el trasplante de genoma es un poco esotérico), pero lograr que funcionen de manera robusta de esta manera y generar una construcción de este tamaño es un logro sorprendente.
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