¿Qué se entiende por clonación de ADN? Dar una breve cuenta.

Una breve respuesta: prepárate.

  • La clonación de ADN es una técnica de biología molecular que hace muchas copias idénticas de un fragmento de ADN, como un gen.
  • En un experimento de clonación típico, un gen objetivo se inserta en una pieza circular de ADN llamada plásmido .
  • El plásmido se introduce en las bacterias mediante un proceso llamado transformación , y las bacterias que llevan el plásmido se seleccionan con antibióticos.
  • Las bacterias con el plásmido correcto se utilizan para producir más ADN plasmídico o, en algunos casos, se inducen para expresar el gen y producir proteínas.

Introducción

Cuando escuche la palabra “clonación”, puede pensar en la clonación de organismos completos, como la oveja Dolly. Sin embargo, todo lo que significa clonar algo es hacer una copia genéticamente exacta del mismo. En un laboratorio de biología molecular, lo que se clona con mayor frecuencia es un gen u otra pequeña pieza de ADN.

Si su amiga, la bióloga molecular, dice que su “clonación” no está funcionando, es casi seguro que está hablando de copiar fragmentos de ADN, ¡no de hacer la próxima Dolly!

Descripción general de la clonación de ADN

La clonación de ADN es el proceso de hacer copias múltiples e idénticas de una pieza particular de ADN. En un procedimiento típico de clonación de ADN, el gen u otro fragmento de ADN de interés (quizás un gen para una proteína humana médicamente importante) se inserta primero en una pieza circular de ADN llamada plásmido . La inserción se realiza utilizando enzimas que “cortan y pegan” el ADN, y produce una molécula de ADN recombinante , o ADN ensamblado a partir de fragmentos de múltiples fuentes.

Diagrama que muestra la construcción de una molécula de ADN recombinante. Una pieza circular de ADN plasmídico tiene voladizos en sus extremos que coinciden con los de un fragmento de gen. El plásmido y el fragmento de gen se unen para producir un plásmido que contiene un gen. Este plásmido que contiene genes es un ejemplo de ADN recombinante, o una molécula de ADN ensamblada a partir de ADN de múltiples fuentes.

A continuación, el plásmido recombinante se introduce en bacterias. Las bacterias que llevan el plásmido se seleccionan y crecen. A medida que se reproducen, replican el plásmido y lo transmiten a su descendencia, haciendo copias del ADN que contiene.

¿Cuál es el punto de hacer muchas copias de una secuencia de ADN en un plásmido? En algunos casos, necesitamos muchas copias de ADN para realizar experimentos o construir nuevos plásmidos. En otros casos, el fragmento de ADN codifica una proteína útil, y las bacterias se utilizan como “fábricas” para producir la proteína. Por ejemplo, el gen de la insulina humana se expresa en la bacteria E. coli para producir insulina utilizada por los diabéticos.

Pasos de clonación de ADN

La clonación de ADN se usa para muchos propósitos. Como ejemplo, veamos cómo se puede usar la clonación de ADN para sintetizar una proteína (como la insulina humana) en bacterias. Los pasos básicos son:

  1. Corte abierto el plásmido y “pegue” en el gen. Este proceso se basa en las enzimas de restricción (que cortan el ADN) y la ADN ligasa (que se une al ADN).
  2. Transforma el plásmido en bacterias. Use la selección de antibióticos para identificar las bacterias que tomaron el plásmido.
  3. Cultive muchas bacterias portadoras de plásmidos y úselas como “fábricas” para producir la proteína. Cosecha la proteína de la bacteria y purifícala.

Echemos un vistazo más de cerca a cada paso.

1. Cortar y pegar ADN

¿Cómo se pueden unir piezas de ADN de diferentes fuentes? Un método común utiliza dos tipos de enzimas: enzimas de restricción y ADN ligasas.

Una enzima de restricción es una enzima de corte de ADN que reconoce una secuencia objetivo específica y corta el ADN en dos partes en ese sitio o cerca de él. Muchas enzimas de restricción producen extremos cortados con voladizos cortos de cadena sencilla. Si dos moléculas tienen voladizos coincidentes, pueden formar pares de bases y permanecer juntas. Sin embargo, no se combinarán para formar una molécula de ADN ininterrumpida hasta que se unan por la ADN ligasa , que sella las brechas en la columna vertebral del ADN.

Nuestro objetivo en la clonación es insertar un gen objetivo (p. Ej., Para la insulina humana) en un plásmido. Usando una enzima de restricción cuidadosamente elegida, digerimos:

  • El plásmido, que tiene un solo sitio de corte.
  • El fragmento del gen objetivo, que tiene un sitio de corte cerca de cada extremo

Luego, combinamos los fragmentos con ADN ligasa, que los une para formar un plásmido recombinante que contiene el gen.

Diagrama que representa la digestión de restricción y la ligadura en un esquema simplificado. Comenzamos con un plásmido bacteriano circular y un gen objetivo. En los dos extremos del gen objetivo hay sitios de restricción, o secuencias de ADN reconocidas por una enzima de restricción particular. En el plásmido, también hay un sitio de restricción reconocido por esa misma enzima, justo después de un promotor que impulsará la expresión en bacterias. Tanto el plásmido como el gen diana se digieren (por separado) con la enzima de restricción. Los fragmentos se purifican y combinan. Tienen “extremos adhesivos” coincidentes o voladizos de ADN monocatenarios, por lo que pueden unirse. La enzima ADN ligasa une los fragmentos con extremos coincidentes para formar una molécula de ADN única e ininterrumpida. Esto produce un plásmido recombinante que contiene el gen objetivo.

2. Transformación bacteriana y selección

Los plásmidos y otros ADN pueden introducirse en bacterias, como la inofensiva E. coli utilizada en los laboratorios, en un proceso llamado transformación . Durante la transformación, las células bacterianas especialmente preparadas reciben un shock (como la alta temperatura) que las alienta a absorber ADN extraño.

El ADN producido por ligadura (que puede ser una mezcla de plásmidos deseados, plásmidos de productos secundarios y piezas de ADN lineales) se agrega a las bacterias. Las bacterias reciben un choque térmico, lo que las hace más aptas para absorber el ADN por transformación. Sin embargo, solo una pequeña minoría de las bacterias absorberá con éxito un plásmido.

Un plásmido generalmente contiene un gen de resistencia a los antibióticos , que permite que las bacterias sobrevivan en presencia de un antibiótico específico. Por lo tanto, las bacterias que tomaron el plásmido pueden seleccionarse en placas de nutrientes que contienen el antibiótico. Las bacterias sin plásmido morirán, mientras que las bacterias que portan un plásmido pueden vivir y reproducirse. Cada bacteria sobreviviente dará lugar a un pequeño grupo, o una colonia , de bacterias idénticas que llevan el mismo plásmido.

Panel izquierdo: diagrama del plásmido, que muestra que contiene un gen de resistencia a los antibióticos. Panel derecho: todas las bacterias de la transformación se colocan en una placa de antibióticos. Las bacterias sin un plásmido morirán debido al antibiótico. Cada bacteria con un plásmido forma una colonia, o un grupo de bacterias clonales que contienen el mismo plásmido. Una colonia típica parece un pequeño punto blanquecino del tamaño de una cabeza de alfiler.

No todas las colonias necesariamente contendrán el plásmido correcto. Esto se debe a que, durante una ligadura, los fragmentos de ADN no siempre se “pegan” exactamente de la manera que pretendemos. En cambio, debemos recolectar ADN de varias colonias y ver si cada una contiene el plásmido correcto. Los métodos como la digestión con enzimas de restricción y la PCR se usan comúnmente para verificar los plásmidos.

3. Producción de proteínas.

Una vez que hemos encontrado una colonia bacteriana con el plásmido correcto, podemos cultivar un gran cultivo de bacterias portadoras de plásmidos. Luego, le damos a las bacterias una señal química que les indica que produzcan la proteína objetivo.

Las bacterias sirven como “fábricas” en miniatura, produciendo grandes cantidades de proteína. Por ejemplo, si nuestro plásmido contuviera el gen de insulina humana, la bacteria comenzaría a transcribir el gen y a traducir el ARNm para producir muchas moléculas de proteína de insulina humana.

Una colonia seleccionada se cultiva en un cultivo grande (por ejemplo, un matraz de 1 litro). Se induce a las bacterias en el cultivo grande a expresar el gen contenido en el plásmido, lo que hace que el gen se transcriba en ARNm y el ARNm se traduzca en proteína. La proteína codificada por el gen se acumula dentro de la bacteria.

Una vez que se ha producido la proteína, las células bacterianas se pueden dividir para liberarla. Hay muchas otras proteínas y macromoléculas flotando en bacterias además de la proteína objetivo (p. Ej., Insulina). Debido a esto, la proteína objetivo debe purificarse o separarse de los otros contenidos de las células mediante técnicas bioquímicas. La proteína purificada puede usarse para experimentos o, en el caso de insulina, administrarse a pacientes.

Usos de la clonación de ADN

Las moléculas de ADN construidas mediante técnicas de clonación se usan para muchos propósitos en biología molecular. Una breve lista de ejemplos incluye:

  • Productos biofarmacéuticos. La clonación de ADN se puede utilizar para hacer proteínas humanas con aplicaciones biomédicas, como la insulina mencionada anteriormente. Otros ejemplos de proteínas recombinantes incluyen la hormona del crecimiento humano, que se administra a pacientes que no pueden sintetizar la hormona, y el activador de plasminógeno tisular (tPA), que se usa para tratar accidentes cerebrovasculares y prevenir coágulos sanguíneos. Las proteínas recombinantes como estas a menudo se producen en bacterias.
  • Terapia de genes. En algunos trastornos genéticos, los pacientes carecen de la forma funcional de un gen en particular. La terapia génica intenta proporcionar una copia normal del gen a las células del cuerpo de un paciente. Por ejemplo, la clonación de ADN se usó para construir plásmidos que contienen una versión normal del gen que no es funcional en la fibrosis quística. Cuando los plásmidos fueron entregados a los pulmones de pacientes con fibrosis quística, la función pulmonar se deterioró menos rápidamente [matemáticas] 2 ^ 2 [/ matemáticas] 2 inicio superíndice, 2, final superíndice.
  • Análisis de genes. En los laboratorios de investigación básica, los biólogos a menudo usan la clonación de ADN para construir versiones artificiales y recombinantes de genes que les ayudan a comprender cómo funcionan los genes normales en un organismo.

Estos son solo algunos ejemplos de cómo se usa la clonación de ADN en biología en la actualidad. La clonación de ADN es una técnica muy común que se utiliza en una gran variedad de aplicaciones de biología molecular.

Saludos 🙂

La clonación del ADN significa hacer copias del ADN multiplicándolas y expresándolas en bacterias / levaduras huésped. En la clonación de ADN primero, el fragmento de ADN (consideremos un gen) se corta del genoma usando enzimas de restricción. Este fragmento se inserta luego en el plásmido vector mediante corte y ligadura con enzimas de restricción. Estos plásmidos generalmente tienen un gen resistente a los antibióticos que puede usarse para la etapa de selección. Ahora, es un plásmido recombinante que tiene un gen de nuestro interés. Este plásmido recombinante se transfiere a una bacteria huésped que tiene una poderosa maquinaria de transcripción y traducción y que reconoce el sitio de origen en el plásmido. Una vez que se realiza la transformación, podemos confirmarla mediante la expresión de genes resistentes a antibióticos. Solo las bacterias que expresan estos genes plasmídicos sobreviven en presencia de antibióticos. Más tarde, estas bacterias de la colonia se recolectan y se aísla su ADN, se purifica el ADN usando histidina u otras etiquetas en una columna, estas etiquetas están presentes en el plásmido vector.

Puedo explicarte esta respuesta de una manera realmente compleja, pero como esperas una respuesta breve, déjame explicarte lo que significa la clonación del ADN de la manera más simple.
Es una sección de ADN que se ha insertado en una molécula de vector, como un plásmido, y luego se ha replicado para formar muchas copias idénticas.

Espero que hayas entendido lo que te había explicado. ;RE

La clonación de ADN es una técnica de biología molecular que hace muchas copias idénticas de un fragmento de ADN , como un gen . En un experimento de clonación típico, un gen objetivo se inserta en una pieza circular de ADN llamada plásmido.