Respuesta corta : 158 kDa (ctrl-F “Masa” en la Fuente); Sí , los sitios objetivo a 80 bps distales probablemente tengan suficiente espacio para que dos proteínas Cas9 se unan simultáneamente.
Respuesta larga (er) : así que reconstruí una imagen de Cas9 unida a su sgRNA y un objetivo de ADN de 20 bps (amarillo), que se muestra a continuación. [1] Cada sitio objetivo en el ADN al que está dirigiendo Cas9 es adyacente a una secuencia PAM; aquí, es 5′-NGG-3 ‘para Streptococcus pyogenes, aunque los investigadores no utilizaron una pieza más larga de ADN objetivo. Si extiende el objetivo de ADN otros 20 pb hacia la izquierda (en esta imagen), la longitud de Cas9 es ~ 40 pb.
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Esto significa que un sitio objetivo (el ADN amarillo en esta imagen) tiene al menos ~ 20 pb flanqueándolo en ambos lados si va a haber dos proteínas Cas9 adyacentes entre sí sin interferir estéricamente con la unión del otro. Para ir a lo seguro, diría que necesita más espacio ( > 50bps ). Si este fuera mi propio proyecto y tuviera que apuntar simultáneamente a dos sitios en el ADN con Cas9, diseñaría los sgRNA para apuntar a sitios > 100bps separados el uno del otro para jugar aún más seguro para “garantizar” que no haya interferencia estérica.
No lo he validado experimentalmente, pero mi deducción es de datos estructurales y vale la pena considerarla.
Quiero señalar que no sé si está tratando de usar dCas9 para simplemente unir, o Cas9 para hacer un corte. Si está utilizando dCas9 para enlazar, y desea un enlace máximo al mismo tiempo, le recomiendo los consejos anteriores. Si proporciona dos sgRNA para que el organismo apunte con dCas9 que están demasiado cerca, probablemente obtendrá un ~ 50% de enlace para cada sitio objetivo. Si está hablando de Cas9, cuán distantes son estos dos sitios objetivo probablemente no importa porque solo desea que se realicen dos cortes; no importa si se cortan al mismo tiempo, siempre y cuando esté hecho.
Credencial rápida: he usado dCas9 en CRISPRi para dos proyectos separados y he diseñado más de una docena de sgRNA.
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Ediciones: cambiaron los valores en negrita para reflejar que el sitio objetivo es una secuencia de 20 pb, no solo la secuencia PAM.
Notas al pie
[1] Estructura cristalina de Cas9 en complejo con ARN guía y ADN objetivo
