¿Cómo funcionan las máquinas de síntesis de oligonucleótidos?

Existe un patrón general para la síntesis en fase sólida de péptidos y oligonucleótidos.

  1. Las cadenas de la resina se desbloquean para que se puedan extender. Esto se realiza con un ácido.
  2. Se agrega un nuevo monómero a las cadenas unidas al soporte de fase sólida; el monómero contiene un grupo de bloqueo que evita la adición adicional
  3. Cualquier cadena que no se haya extendido está tapada para que no se pueda extender
  4. En la química actual de fosforamidita, el enlace inicial entre las bases es un fosfito, no fosfato, y debe oxidarse.

Los pasos de lavado se utilizan entre algunos (o tal vez todos; no ejecuto un sintetizador) para prepararse para la siguiente etapa. Al final de la síntesis, los grupos protectores se eliminan de ciertas bases (que de otro modo estarían sujetas al ataque de los fosforamiditos) y el oligo se escinde de la columna. Síntesis de oligonucleótidos – Wikipedia

El desafío clave en cualquiera de estas síntesis cíclicas es que ningún paso llega al 100% para completarse, el problema del rendimiento cíclico (o repetitivo). Puede pensar que el 99% de finalización suena bien, pero tome una calculadora y aumente eso a la potencia número 100; esa es la fracción de una síntesis de 100 nucleótidos que es el producto correcto. Dado que la mayoría de las fallas son más cortas, es por eso que puede pagar más por la purificación por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) para aplicaciones críticas.

Para los sintetizadores de tipo matriz, el desbloqueo o el paso de adición ocurren solo donde se ilumina la luz. Affymax fue pionera en este enfoque para los péptidos y luego desarrolló el Affymetrix mucho más exitoso que lo aplicó a los oligonucleótidos. Affymetrix controlaba la luz usando máscaras físicas, al igual que la fabricación de circuitos integrados. Estas máscaras eran caras y tomaban mucho tiempo, por lo que los chips Affy personalizados eran caros y una larga ventaja para el primer chip, pero barato para los adicionales.

NimbleGen fue pionero en el uso de tecnología de microespejo programable para dirigir la luz a la matriz, la misma tecnología utilizada en televisores de proyección de gran tamaño. Esto eliminó la necesidad de máscaras, permitiendo una producción rápida de chips personalizados. CombiMatrix desarrolló una tecnología de matriz que utiliza señales eléctricas para realizar el desbloqueo; La tecnología de Febit creo que era similar.

Agilent terminó adquiriendo tecnología de inyección de tinta para imprimir matrices de oligo; Originalmente, esto había sido iniciado por el laboratorio de Lee Hood. Nuevamente, esto permitió una programación rápida de las matrices. Agilent también trabajó muy duro para obtener un rendimiento cíclico muy alto, lo que permitió la síntesis de matriz de 200 mers.

Twist Biosciences tiene un proceso más nuevo que involucra la síntesis en micropocillos, pero ha estado muy callado sobre los detalles de cómo dirigen la síntesis. Una de las otras respuestas menciona la tecnología microfluídica uParaflow.

La síntesis de Oligo es interesante porque ocurre 3 ‘-> 5’, lo contrario de las síntesis biológicas. Otra peculiaridad de la química de la fosfoamidita de síntesis de oligo es que está completamente envenenada por el agua. Por lo tanto, los solventes utilizados deben ser de una calidad exquisita. El disolvente primario utilizado es acetonitrilo. Durante el colapso económico de 2008–2009, la caída en las ventas de automóviles causó que los suministros de acetonitrilo cayeran en picada, ya que el acetonitrilo se produce principalmente como un subproducto de la producción de componentes de pintura para automóviles. (Sé que esto suena absurdo, pero es real).

Reemplazar estos métodos químicos de síntesis de oligonucleótidos con métodos enzimáticos es un área candente, con varios grupos académicos y nuevas empresas que lo persiguen. La esperanza es reducir los costos, esos solventes ultrasecos son caros, aumentar las longitudes que se pueden sintetizar y reducir la cantidad de residuos químicos desagradables generados.

El primer nucleótido (el 3′-OH en el extremo 3 ‘de la secuencia) se une a una resina a través de un enlace dependiente de amina que se escinde más tarde. Todos los nucleótidos se agregan luego a este nucleótido 3 ‘a través de un ataque 3′-OH del grupo entrante al 5’-trifosfato del grupo estacionario, lo que conduce a la formación de un enlace de anhídrido de fosfato y la liberación del resto pirofosfato de alta energía. Luego entra el siguiente nucleótido, y así sucesivamente. En cuanto a cómo la máquina sabe qué nucleótido agregar en cada paso, bueno, lee la secuencia predicha que ingresó. Lo único interesante acerca de cómo funciona un sintetizador oligo es que la dirección de síntesis es de 3 ‘a 5’, mientras que en vivo, el ADN y el ARN se sintetizan en una dirección de 5 ‘a 3’.