¿Cuáles son algunas de las mejores prácticas de Western blot y consejos para la solución de problemas?

Este póster fue colocado apropiadamente sobre la cámara CCD en mi laboratorio anterior.

Las manchas occidentales son tanto una forma de arte como un protocolo científico. Un poco de suerte también va un largo camino. Aquí hay algunos consejos que encontré en línea y durante muchas horas arduas en el laboratorio que ayudaron a mi experiencia de borrado:

  • Si se observan señales débiles o nulas, el aumento de la concentración de anticuerpos varias veces podría ayudar. Algunos anticuerpos tienen baja afinidad con su proteína de interés.
  • Si se observan demasiadas bandas, la unión inespecífica puede ser la causa. Intenta no sobrecargar el gel. Ejecutar un control (por ejemplo, un anticuerpo secundario sin primario) podría resolver el problema.
  • Si hay un fondo alto a través de la mancha, usar un reactivo de bloqueo diferente, aumentar el número de lavados y / o reducir el tiempo de exposición podría ayudar.
  • Si aparecen puntos negros, los anticuerpos reaccionan con el agente bloqueante. Filtrar el agente de bloqueo generalmente funciona.
  • A veces, el material que se utiliza son las fuentes de error. Su muestra puede haberse congelado y descongelado demasiadas veces. Las membranas de baja calidad pueden causar una transferencia de proteínas subóptima. Los anticuerpos que están viejos, almacenados incorrectamente, contaminados y / o expuestos a temperatura ambiente por períodos prolongados pueden perder su actividad. Si es posible, compre reactivos comerciales y anticuerpos de alta calidad que hayan sido probados.

Una vez, cambiar la unidad de electroforesis resolvió mi problema. O la contaminación fue la culpable, o un poder superior de la ciencia prestó una mano amiga. Nunca lo sabré.