Copiado y actualizado de ¿Cuáles son algunas buenas maneras para que un individuo se prepare para iGEM? según lo solicitado por Nick. Tenga en cuenta que esto es lo que me pareció personalmente útil y puede que no se aplique a todos. Disculpas por la longitud. Prefiero equivocarme por ser demasiado detallado que no ser lo suficientemente detallado. Las cosas que son útiles, no se enseñan en los libros de texto, pero no estoy cubriendo aquí son 1) cómo hacer búsquedas de literatura 2) cómo leer la literatura 3) cómo pensar en grandes ideas de proyectos 4) cómo mantenerse motivado y muchos otros, estoy seguro.
Algo a tener en cuenta es el análisis de costo / beneficio y usarlo como motivación para hacer muchas cosas en paralelo y lanzar esos pequeños experimentos adicionales que podrían decirle mucho sobre su sistema. Por ejemplo, supongamos que está haciendo 5 PCR y 1 de ellos falló. En lugar de intentar solucionar problemas en serie, debe probar muchas cosas a la vez (pruebe diferentes polimerasas, pruebe diferentes Tms). Otro ejemplo sería que no sabe cuánta proteína particular necesita (su diseño inicial siempre supondrá que tiene niveles perfectos de esa proteína, esto casi nunca es el caso), por lo que podría 1) clonar el gen después promotores de potencia conocida 2) clonarlo después de un promotor inducible como Pbad o 3) clonarlo en plásmidos de varios números de copia o 4) hacer una biblioteca rbs y seleccionar> 24 clones para analizar o 5) clonarlo en un plásmido DIAL y transformarlo en cepas con varios números de copia http://www.jbioleng.org/content/….
La clave para recordar es que la clonación lleva mucho tiempo. Es su tiempo lo que termina siendo costoso, no los reactivos (suponiendo la clonación estándar y un laboratorio con fondos decentes). Por lo tanto, en general, trate de encontrar las suposiciones que podrían hundir su barco y realice experimentos paralelos para asegurarse de que no lo hagan. Desea fallar temprano y fallar a menudo. Cuanto antes falle (descubra que algo está mal), antes podrá redirigir y hacer que realmente funcione. Por lo tanto, vale la pena invertir esos pequeños experimentos adicionales que pueden probar sus suposiciones básicas y ayudarlo a fallar antes.
- ¿Qué es una cartilla de avance?
- ¿Por qué se necesita una longitud de onda de luz más corta para observar pequeñas partículas u organismos que no son visibles a simple vista?
- ¿Qué reactivos se utilizan para extraer ADN y ARN? ¿Como funciona?
- ¿Cuál es la base de datos de secuencias de proteínas ambientales (env_nr) en la web de NCBI?
- Cuando la célula se ha estancado, la bifurcación de la replicación del ADN, ¿qué punto de control debe activarse predominantemente?
Siempre piense en caminos alternativos hacia su objetivo final. Y piense en cuál es realmente su objetivo final. A menudo no es “mostrar X usando las partes Y y Z”. Es simplemente “mostrar X usando cualquier parte que funcione”. La evolución encuentra respuestas a los problemas mediante el muestreo de la diversidad. Ese es el enfoque que debe adoptar también para “mostrar X”, hacer una búsqueda en la literatura y encontrar todos los componentes que podrían utilizarse para construir un sistema para “mostrar X”.
Los números realmente pueden importar también. ¿Es simplemente “mostrar X” o “mostrar X con un 99% de eficiencia”? Si es así, es posible que deba cuantificar cada una de las piezas individuales de su sistema y definir métricas de corte para lo que es “suficientemente bueno”.
Otros consejos fuera de mi cabeza: 1) Aprender a clonar es clave. Hay muchos recursos en Internet, pero lo señalaré a http://openwetware.org/wiki/Arki… de mi asesor y al canal de youtube que mi compañero de laboratorio creó http://www.youtube.com/user / bioe …) Aprenda sobre los diferentes plásmidos, cuáles son sus números de copia y quién es incompatible con qué. Este es un buen lugar para comenzar
http://www.qiagen.com/plasmid/ba… Después de eso, aprenda también sobre el origen R6K.
2) Si está haciendo una PCR y una subclonación, intente clonar en un vector con un reportero de GFP como fondo. Básicamente, cortarías el gen GFP y lo reemplazarías con tu ADN. De esa manera, 1) obtiene el beneficio de una mayor separación en el gel y 2) cuando inspecciona las colonias en la placa, puede detectar colonias no verdes y saber que probablemente contengan su inserto. sfGFP es un gran reportero para este propósito, es realmente verde. http://partsregistry.org/Part:BB… y también puedes comprar algunas linternas UV baratas (
http://www.amazon.com/dp/B001VZC5LA
haga coincidir la salida con la longitud de onda de excitación GFP) para excitar el fluoróforo en su mesa de trabajo. RFP también está bien, pero en nuestras manos necesita más tiempo para madurar / hacerse visible. 
3) Nuestro flujo de trabajo de PCR estándar es: intente una vez con Phusion o Expand, pruebe la solución de problemas del fregadero de la cocina, rediseñe los cebadores o cuestione el material de su plantilla (¿demasiado complejo? ¿ADN degradado? ¿Secuencia incorrecta?).
3a) También estandarizamos nuestros protocolos de PCR. Entonces, en cada máquina habrá los programas 1K55, 2K55, 3K55, etc. Estos serán Tm = 55C, con tiempos de extensión de 1kb, 2kb, 3kb, etc. De esta manera, no hay edición de programas y ninguna pregunta sobre lo que hizo.
3b) Las muestras / plásmidos de otras fuentes / personas a menudo están equivocadas. Siempre secuencia o verifica la función. Nunca asumas que la muestra es lo que dicen que es hasta que te la pruebes. Los datos de secuencia depositados en NCBI también pueden estar equivocados en mi experiencia.
4) Desarrolle software u hojas de cálculo para realizar un seguimiento de las muestras. Hay demasiada incertidumbre en la biología molecular tal como es. No permita que su holgazanería en los tubos de etiquetado o que tenga un buen sistema de seguimiento de muestras aumente esa incertidumbre. Una buena regla general es: “¿Podré decir qué es este tubo o muestra dentro de 6 meses?”
4a) Me gusta usar una combinación de hojas de cálculo de Google y ApE para almacenar mis datos y manipular la secuencia, respectivamente. Algo más que hice fue desarrollar ecuaciones de hoja de cálculo para calcular automáticamente los tamaños de fragmentos para mis resúmenes y advertirme si el fragmento deseado está demasiado cerca del fragmento de fondo. En pocas palabras, si te encuentras haciendo algo repetitivo en la computadora, probablemente necesites algún tipo de script o programa para automatizarlo; Las computadoras pueden reducir el tiempo dedicado a esas tareas en 100 veces, pero no pueden ayudarlo a pipetear (todavía).
4b) De manera similar, para las lecturas de secuenciación, es posible escribir fórmulas simples que busquen la secuencia esperada dentro de la lectura de secuencia real y le indiquen automáticamente si la lectura es 100% correcta o si hay un problema. Luego puede realizar un seguimiento manual con una alineación más detallada. El objetivo es obtener una solución que sea lo suficientemente buena en lugar de algo que cubra todos los casos de uso.
5) En la misma línea, intente racionalizar y estandarizar los flujos de trabajo. La PCR, digerir, ligar, transformar, miniprep es un buen ejemplo. Desarrolle su propia rutina y SIEMPRE manténgala. De esa manera, nunca olvida un paso clave y puede realizar un seguimiento mental o literal de las eficiencias aproximadas (esos porcentajes de éxito de los que habla Christopher VanLang) de cada paso y sabrá lo antes posible si no se ve bien.
6) Controles. Los controles ayudan a familiarizarlo con las limitaciones de un nuevo protocolo y ayudan a desacreditar las suposiciones falsas que hizo durante el diseño. Puede ver un efecto cuando ejecuta la muestra experimental, pero si también lo ve en la muestra de control, sugiere fuertemente que no se debe al mecanismo que cree. SIEMPRE piense en los controles positivos y negativos que podría ejecutar para solucionar problemas de su protocolo o su diseño.
7) Conozca y use soluciones para mejorar la productividad. Un ejemplo es el colector de vacío (lo llamamos el cerdo) para hacer minipreps. Otra sería usar la pipeta multicanal. Siempre pregúntese a sí mismo o a las personas más experimentadas “¿cómo puedo hacer esto mejor / más rápido?” Si no puede permitirse comprar el múltiple, considere construir uno. Debería ser posible armar un jurado con una tubería de PVC y otras partes de plásmidos, he visto algunas startups en etapas tempranas hacerlo.7a) Juegue con los protocolos recomendados por el fabricante. Por ejemplo, para minipreps, generalmente está bien reducir los tiempos de centrifugado a 15 s, excepto para el centrifugado de secado final.
7b) Tareas de laboratorio como hacer LB, placas de agar, etc. Si estos medios son solo para crecer cosas para miniprepping, etc., está bien falsificar un poco los números, a las bacterias no les importará si había 24 o 25g / L , simplemente están felices de estar vivos. Lo que hicimos fue comprar un montón de cucharadas (como las de las tinas de proteína en polvo) y comprar tinas grandes de polvo LB. Compramos cucharadas que tenían aproximadamente el volumen correcto para obtener 25 g cada cucharada. De esa manera, no tiene que perder el tiempo midiendo el polvo cada vez que crea medios LB.
8) Marcadores visuales. Digamos que está pipeteando una mezcla maestra en 10 tubos. Después de haber pipeteado en un tubo, muévalo hacia arriba un punto en su rejilla para tubos. De esa manera, puede realizar un seguimiento de los tubos en los que ya ha pipeteado.
www.bitesizebio.com a menudo tiene discusiones y artículos en este sentido, aunque su calidad parece haber disminuido recientemente.
9) No holgazanear durante los tiempos de incubación. Esa espera de 30 minutos para que las enzimas se digieran NO ES para que usted vea Facebook. Podría estar configurando el próximo experimento o respondiendo preguntas sobre quora 😉 Encuentre un temporizador múltiple y úselo. Solía usar http://skwire.dcmembers.com/fp/?… y recientemente comenzamos a desarrollar un temporizador javascript / html con más funciones útiles para molbio http://dl.dropbox.com/u/2961290/…
(Me gusta etiquetar cada temporizador y escribiré notas diciéndome qué hacer cuando aparezca el cuadro de notificación). El cerebro humano solo puede realizar un seguimiento de aproximadamente 4-6 cosas (creo) a la vez en la memoria a corto plazo. Desarrolle técnicas para facilitarle las cosas a medida que el contexto cambia su cerebro de un experimento a otro.
10) (más específico de iGEM) Sea un buen invitado en el laboratorio. Sé amable con los estudiantes de posgrado. Pregúnteles si quieren ayuda para hacer reactivos comunes. Asegúrese de decirles si algo se está agotando. ¡No los cabrees! Deja las cosas más limpias de lo que las encontraste.
11) (más específico de iGEM) Tener reuniones productivas. Muchas reuniones terminan con una lista de acciones, pero nadie es responsable de ellas. Voluntario para cuidar los elementos de acción a medida que surjan. Haga que alguien sea un escriba y tome notas de quién necesita hacer lo que se debe hacer en la próxima reunión. Hazte responsable.
12) Mantenga una lista diaria de tareas. Al final de cada día, escriba lo que debe hacer mañana dirigido a Future You. De esa manera, cuando vienes por la mañana, no hay retraso en averiguar lo que tienes que hacer. Pasado Ya se ha tomado el tiempo de escribir una nota agradable que enumere lo que debe hacerse. las tareas de google me funcionan bien https://mail.google.com/tasks/ca…
13) En nuestra experiencia, las células competentes de KCM / TSS parecen ser tanto las más fáciles de preparar como las más competentes. Protocolos de muestra para
Preparación: http://openwetware.org/wiki/IGEM… Uso:
http://openwetware.org/wiki/IGEM…
14) Desafortunadamente, las herramientas y bases de datos bioinformáticas están muy dispersas en la web, no están organizadas y no están estandarizadas. Tómese el tiempo para familiarizarse con cada base de datos o herramienta, a la larga dará sus frutos. BLAST (todos los sabores diferentes) es probablemente algo que querrás aprender lo antes posible, ya que te ayuda a identificar cuál es tu secuencia (para asegurarte de que estás clonando la cosa completa en lugar de un poco de truncamiento). Para obtener rápidamente el ADN genómico, pruebe mis PCR genómicas o simplemente explore el genoma de E. Coli. Me gusta usar http://microbes.ucsc.edu/cgi-bin…
15) Aprenda qué enzimas de restricción tienen buenos resultados y cuáles son malas. En general, si observa las unidades que vende NEB por $ 250, eso es una buena indicación de qué tan bien funcionará esa enzima. Algunas enzimas generalmente son cortadores de mierda o tienden a asociarse con el ADN y causan manchas en el gel. Además, lea la sección completa de preguntas frecuentes sobre la enzima de restricción con la que tiene problemas. NEB y Fermentas suelen ser bastante buenos para decirle qué problemas pueden ocurrir. No todas las enzimas de restricción se crean por igual.
16) Las incubadoras de huevos estilo “Hova bator” son formas económicas de obtener una incubadora adicional de 30C sin gastar una tonelada de dinero.
16a) puede construir su propio generador de imágenes de gel y ahorrar dinero y tener un control mucho mayor sobre el disparo y dónde guarda / carga el archivo JPG. Esquemas del laboratorio de Bustamante.
http://panic.berkeley.edu/~ghe/G… otras ideas de bricolaje de DIYbio
http://openwetware.org/wiki/DIYb…
17) ¡Preparar tu propia cerveza es una excelente manera de practicar la microbiología!
18) Las estimaciones de tiempo son siempre probabilidades. Cuando recién comienza, es mejor multiplicar el número de días planificados por 2 o más. Después de comenzar a recopilar estadísticas, puede tener una mejor idea de cuánto tiempo tomarán las cosas y qué partes son riesgosas. Saber cuánto tardarán las cosas te ayudará a sentirte más en control del proyecto y a tener sentimientos de impotencia. Del mismo modo, siempre mantenga la probabilidad y las estadísticas a la vanguardia al tomar decisiones. Pese la información con una probabilidad de ser cierta (o su interpretación particular sea verdadera). Busque planes de respaldo … si algo tiene un 10% de probabilidades de estar mal, pero tiene otro plan de respaldo que también tiene un 20% de posibilidades de estar equivocado, la probabilidad de que ambos no funcionen será bastante baja.
19) ponga información donde la necesite. Por ejemplo, escriba el antibiótico que le aplicará en el tubo de rescate. Etiquete los tubos y las placas que deberían crecer a 30 ° C con un trozo adicional de cinta adhesiva en la parte superior para diferenciarlas claramente de las placas que deben colocarse en el bator 37 ° C. Escriba lo que debe hacer al día siguiente en tubos de cultivo para que pueda leerlo y actualizar inmediatamente los contextos. Me gusta pensar que se trata de cargar programas en la RAM.
20) addgene y ATCC son excelentes formas de obtener plásmidos o cepas. Creo que el registro también envía ADN http://partsregistry.org/Main_Page si los envía por correo electrónico (solo espere un retraso prolongado durante el jamborree de iGEM, ya que estarán demasiado ocupados).
A menudo, otros investigadores están más que felices de enviarle muestras y cepas si paga el envío. Muchos de ellos también son excelentes para enviar correos electrónicos para hacer preguntas.
21) Y lo más importante, piense en lo que quiere obtener de iGEM / lab / grad school. ¿Es para tener una idea de cómo sería la escuela de posgrado? ¿Es para tener una idea de lo que es la biología sintética? ¿Es para trabajar en un proyecto de ciencia en equipo? Piensa activamente y busca la información y las experiencias que deseas.
