¿Cómo se calcularon los errores de transcripción y replicación?

Una técnica requiere ARN polimerasa purificada, una pieza muy simple de plantilla de ADN donde todas las bases a transcribir son las mismas, el NTP correcto para transcribir la plantilla con un radiomarcador y todos los demás NTP con otro radiomarcador. Por ejemplo, si la plantilla fuera ADN de poli-A, el NTP correcto para incorporar sería 3H-UTP, y los NTP incorrectos tendrían una etiqueta 32P (en fosfato de alfa). El ARNm transcrito correctamente tendría solo 3H, no 32P: al cuantificar la proporción real de incorporación, puede obtener la tasa de error. Los principales obstáculos experimentales son (a) probar que su tampón in vitro no es tan terrible que hace que la ARN polimerasa sea más propensa a errores de lo normal y (b) obtener suficiente sensibilidad para detectar un error por cada 10 ^ 5 incorporaciones.

Otra opción que permite mediciones in vivo es crear una construcción informadora: en este caso, un gen que codifica una versión mutada de una proteína que de otro modo sería fácilmente detectable, como una enzima o una proteína fluorescente. Si el gen se transcribe normalmente, entonces el ARNm tiene un error y no se produce la proteína funcional (a menos que ocurra un error en la traducción). Pero si se comete un error en la transcripción que termina corrigiendo la mutación para hacer una proteína funcional nuevamente, entonces se harán muchas copias de la proteína funcional a partir de ese ARNm, e idealmente la actividad de la proteína es detectable sobre el error de traducción de fondo.

Todavía se están describiendo opciones más modernas, incluida una descrita por el grupo Lynch en PNAS en noviembre pasado. Su método puede usarse para determinar la tasa de error in vivo marcando de manera única los ARNm individuales recolectados de un organismo, transcribiéndolos inversamente en ADNc (que también produce copias adicionales) y secuenciando el ADNc. Por supuesto, los dos últimos pasos introducen errores propios, pero esto se explica estadísticamente y también de una manera inteligente: los errores en el ARNm original terminarán en todas las lecturas de secuenciación, pero los errores en una sola copia de ADNc o de la secuencia misma no afectará todas las lecturas. De esta manera, se pueden distinguir los tres tipos de errores y recuperar la tasa de error de transcripción.

Ejemplo de método basado en radiactividad.
Papel del grupo Lynch