¿Qué reactivos se utilizan para extraer ADN y ARN? ¿Como funciona?

Han pasado 15 años desde que hice eso, más que un poco incompleto en este momento, pero creo que los principios aún se mantienen. Aquí hay un poco reconstruido:

  1. Células Lyse (incluida la posibilidad de congelar / moler). Si se extrae ARN y las células eucariotas son la fuente, los núcleos se deben mantener intactos (es una cuestión de detergente usado).
  2. Precipitar cualquier biopolímero que no sea ácido nucleico; centrifugadora / centrifugadora; mantener la fase acuosa con ácidos nucleicos
  3. Precipitar ácidos nucleicos del sobrenadante restante
  4. Lavar; eliminar contaminantes

Por lo tanto, la idea es romper primero las células, luego hacer que las proteínas sean insolubles desnaturalizándolas y separando el precipitado junto con orgánulos o fragmentos de membrana / pared celular y polímeros de carbohidratos. Si el ADN no es de interés, mantener los núcleos intactos permite separarlos girando. Luego precipite los ácidos nucleicos restantes del sobrenadante, típicamente usando etanol.

Las proteínas pueden desnaturalizarse, por ejemplo, mediante tratamiento con fenol / cloroformo / alcohol isoamílico , SDS o tiocianato de guanidina . Los ácidos nucleicos se precipitan comúnmente usando acetato de sodio y etanol . Las cadenas más grandes son menos solubles y precipitan a concentraciones más bajas de etanol. De esta manera, la etapa de extracción se puede utilizar para filtrar el tamaño del polímero (por ejemplo, miRNA). Viceversa, si el ADN es de interés, la extracción con una concentración de etanol más baja puede precipitar el ADN, y el ARN en solución puede descartarse. El ARN también puede precipitarse selectivamente usando cloruro de litio (LiCl) .

El ARN contaminante se puede eliminar con ribonucleasa , y el ADN contaminante con desoxirribonucleasa .

En la extracción de ARN, las soluciones se tratan comúnmente con DEPC para eliminar cualquier actividad de ARNasa (ribonucleasa), algunos materiales se pueden lavar con cloroformo .

En los gradientes de CsCl, el ARN se sedimentará más rápido que el ADN porque es más denso que el ADN (presumiblemente por tener un oxígeno más).

También la temperatura (enfriamiento) es un parámetro típico para controlar la solubilidad.

Puede encontrar una interesante colección de protocolos de extracción de ARN aquí:

Capítulo diecinueve – Purificación de ARN – Métodos de precipitación (el pdf se puede encontrar en ResearchGate)