¿Cuáles son los límites de la edición de genes CRISPR?

La relación HDR a NHEJ es prácticamente el mayor problema al usar CRISPR-Cas9 para la edición de genes.

Ahora, cuando hablo de Edición, no me estoy refiriendo a simplemente eliminar ese gen o este gen, sino que editarlo con tanta precisión cambia la secuencia que de alguna manera puede afectar la función del gen.

Entonces, ¿cómo lograr esto?

La idea es:

  • transfecta las células con Cas 9 + el sgRNA (el ARN guía que dirigirá el Cas 9 a tu gen de interés y la secuencia de reparación
  • El sgRNA Cas9 + causa una rotura de doble cadena (DSB) en el ADN, esto activa la cascada DR (respuesta al daño)
  • En este punto, ha proporcionado una secuencia de reparación (puede ser un ADN de doble cadena o un ADN de cadena sencilla). Esta secuencia de reparación posee regiones flanqueantes que son las mismas que las regiones flanqueantes donde indujo el DSB. Ahora, si se usa el mecanismo HDR (reparación directa de homología) para reparar el DSB, su secuencia de reparación se usa como plantilla para reparar el daño al “llenar el espacio”, de modo que lo que esté contenido entre las regiones de flanqueo se insertará donde indujo el DSB.

Esto en teoría.

Las células de realidad IN poseen otras vías que están involucradas en la reparación del ADN, una de ellas es el NHEJ (unión final no homóloga), este mecanismo (junto con Alt-NHEJ, NHEJ alternativo y SSA, recocido de cadena simple) es un error mecanismo propenso que solo toma los dos extremos que flanquean el DSB y los junta. Entonces, lo que fue cortado por Cas9 + sgRNA, se pierde. Ahora, aunque este es el mecanismo utilizado cuando los investigadores quieren hacer un KO, esto es lo que queremos evitar cuando deseamos EDITAR un gen, ¡porque NHEJ no usará la secuencia de reparación que proporcionamos! ¿Ves a lo que me refiero? Y el problema es que, en comparación con HDR, el NHEJ ocurre cada vez con más frecuencia que HDR (esto depende del ciclo celular y del paisaje de cromatina), de modo que en la mayoría de los casos menos del 10% de las células se editan correctamente. Este es un problema muy grande ya que requiere una gran selección de clones que consumen mucho tiempo (las pocas celdas que se editan con éxito) y pasos de amplificación.

Así es como la literatura está llena de grupos que publican artículos sobre formas y enfoques para mejorar la relación HDR / NHEJ (sintetizando diferentes Cas9, uso de Cas9 modificado, diferentes formas de entregar el Cas9, etc.). Pero la mayoría de ellos se caracterizan por una gran variabilidad, por lo que en algunos casos este enfoque funciona, mientras que en otros funciona menos y en otros no funciona en absoluto.