Las respuestas anteriores cubren la mayoría de los tecnicismos del diseño de imprimación, pero me gustaría agregar algunas cosas más. El diseño del cebador se vuelve muy fácil con una comprensión clara de los conceptos básicos de la replicación del ADN (después de todo, estamos diseñando cebadores para replicar el ADN en una PCR). Las cosas clave para recordar de la biología molecular 101 son:
1. La síntesis de nuevas cadenas siempre ocurre en la dirección de 5 ‘a 3’.
2. Las dos cadenas de ADN son siempre complementarias entre sí.
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3. Las terminologías como cadena de sentido / cadena de codificación / cadena sin plantilla o cadena antisentido / cadena sin codificación / cadena de plantilla también son útiles.
(Si la molécula de ADN dada es bicatenaria, la cadena que corre en dirección de 5 ‘a 3’ se denomina cadena de sentido / cadena de codificación / cadena sin plantilla. Esta es la cadena con la misma secuencia que el ARNm y, por lo tanto, la nomenclatura De manera similar, la cadena que corre en dirección de 3 ‘a 5’ se denomina cadena antisentido / cadena no codificante / cadena plantilla. Esta es la cadena que generalmente se transcribe en el ARNm)
4. Finalmente, la convención de escritura, si no se especifica la direccionalidad de una molécula de ADN, como convención, en un ADN bicatenario la hebra superior corre en dirección de 5 ‘a 3’ mientras que la hebra inferior corre en 3 ‘a 5’ dirección. Si solo se administra una sola cadena de ADN, es seguro asumir que corre en dirección de 5 ‘a 3’.
Después de aclarar todo esto, el diseño de imprimación es pan comido. Para diseñar el Forward Primer, use las primeras 15-20 bases del filamento de la plantilla y para diseñar el Reverse Primer, use las últimas 15-20 bases de la plantilla y haga un cumplido inverso (es decir, tome las últimas 15-20 bases, escriba su secuencia complementaria y luego léala en la dirección inversa).
Al hacer esto, tendrá un conjunto de cebadores directos e inversos que podrían usarse para amplificar el ADN en una PCR. Ambos cebadores tendrán una direccionalidad de 5 ‘a 3’. Es fundamental verificar los parámetros como la longitud, la temperatura de fusión y el contenido de GC de este par de cebadores para una reacción de PCR exitosa. El par de imprimación no debe ser muy diferente en sus temperaturas de fusión (generalmente dentro de 5 grados entre sí). Los cebadores no deben ser demasiado altos o bajos en su contenido de GC y siempre es una buena idea tener un G o C en el extremo 3 ‘del cebador, para garantizar una unión firme. Finalmente, se podrían agregar sitios de restricción o secuencias homólogas para la clonación en el extremo 5 ‘. Tener un par de bases adicionales junto con el sitio de restricción ayuda a garantizar una digestión adecuada.
