Cómo cuantificar el contenido de ácidos carboxílicos en una muestra La Ciencia y la Tecnología mejoran el futuro

RESUMEN

Se proporciona un método de identificación y análisis cuantitativo de ácido (s) carboxílico (s) en una muestra por espectrometría de masas usando un estándar interno marcado con isótopos estables. Dicho patrón interno se prepara por reacción de una muestra auténtica de dicho ácido carboxílico con un reactivo marcado con isótopos estables, y se agrega a una muestra que contiene dicho ácido carboxílico. Dicho ácido carboxílico en dicha muestra se convierte cuantitativamente en un compuesto químico de estructura idéntica, excepto los átomos de isótopos estables, como el de dicho patrón interno usando un reactivo no marcado. Dicha muestra se extrae y el extracto se analiza por espectrometría de masas. La identificación y cuantificación de dicho ácido carboxílico se realiza a partir de una gráfica de la relación iónica de dicho ácido carboxílico convertido a dicho estándar interno frente a la concentración de ácido carboxílico.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Esta invención se refiere a métodos de análisis cuantitativo de ácidos carboxílicos en una muestra por espectrometría de masas por dilución isotópica. Los ésteres marcados con isótopos estables se usan como patrones internos. La muestra puede ser un fluido biológico, como suero, orina, etc., o una muestra acuosa, como una muestra ambiental o agrícola.

Mientras que varios métodos de análisis, como los inmunoensayos y el análisis cromatográfico (LC (cromatografía líquida), GC (cromatografía de gases) y TLC (cromatografía de capa fina)) se han informado para la identificación y determinación de los niveles de ácidos carboxílicos en muestras analíticas, el absoluto y la identificación inequívoca y el análisis cuantitativo de esos compuestos son combinaciones de análisis cromatográfico y MS (espectrometría de masas) como GC-MS y LC-MS. La precisión y la precisión de estos métodos son generalmente las más altas cuando se usan análogos de isótopos estables de los analitos como estándares internos.

El método de análisis de espectrometría de masas que utiliza estándares internos de isótopos estables se denomina comúnmente espectrometría de masas por dilución de isótopos. Este método aprovecha los comportamientos químicos y físicos similares de los analitos y sus respectivos patrones internos etiquetados con isótopos hacia todas las fases de preparación de la muestra y también hacia las respuestas del instrumento. Utiliza la diferenciación de masa entre analitos y sus respectivos estándares internos en espectrometría de masas para la cuantificación. El requisito para este método de análisis es la disponibilidad de estándares internos de isótopos estables etiquetados.

El estándar interno de un analito marcado con isótopos estables comúnmente utilizado es un compuesto químico que tiene la misma estructura química que la del analito, excepto que uno o más átomos sustituyentes son isótopos estables. Cuatro isótopos estables comúnmente utilizados son el deuterio, el carbono 13, el nitrógeno 15 y el oxígeno 18. Por cada átomo de hidrógeno que se reemplaza por un átomo de deuterio, el peso molecular del compuesto químico resultante se incrementa en una unidad de masa. Esto también es cierto para reemplazar un átomo de carbono con un átomo de carbono 13, o al reemplazar un átomo de nitrógeno con un átomo de nitrógeno 15. En el caso de reemplazar un átomo de oxígeno con un átomo de oxígeno-18, el aumento molecular es de dos unidades de masa. Aunque el estándar interno aceptable marcado con isótopos estables para el método de espectrometría de masas por dilución de isótopos es el que no está contaminado con ninguno de los materiales no etiquetados, el ideal debería ser el que tenga la mayor pureza isotópica y contenga tantos átomos de isótopos estables como sea posible. Sin embargo, el ideal no debe contener ningún isótopo marcado que pueda intercambiarse por el isótopo no marcado bajo condiciones particulares de preparación de la muestra.

Estos criterios de un estándar interno ideal marcado con isótopos estables presentan un desafío para los químicos de síntesis orgánica que ayudan a los químicos analíticos en el análisis. Muy a menudo, la síntesis de patrones internos de isótopos estables no es simplemente una reacción de intercambio de isótopos. Los átomos fácilmente intercambiables generalmente se deben al posible re-intercambio durante los pasos de preparación de la muestra. Los químicos orgánicos a menudo tienen que llevar a cabo síntesis de múltiples pasos para hacer estándares internos etiquetados con isótopos estables. Aunque muchos reactivos marcados con isótopos estables están disponibles comercialmente, la elección del reactivo marcado apropiado para la síntesis química de patrones internos marcados con isótopos estables es todavía muy limitada. Los reactivos marcados con isótopos limitados y la síntesis de múltiples pasos contribuyen al alto costo de síntesis de estándares internos de isótopos estables. Incluso si el químico analítico que realiza el análisis puede pagar el costo de la síntesis, también hay un factor de tiempo que debe considerar antes de ordenar la síntesis. Las situaciones en las que los químicos orgánicos pasaron semanas y meses en un proyecto de síntesis y no encontraron nada al final eran comunes. Esta invención ofrece una solución para este problema.

El objetivo es un método corto y confiable para preparar un estándar interno marcado con isótopos estables que sea adecuado para el análisis de MS de un analito en cuestión, pero no la síntesis del analito marcado con isótopos estables. Dentro del contexto del método de espectrometría de masas por dilución de isótopos, tanto el analito como su estándar interno deben tener estructuras químicas idénticas, con la excepción de los átomos de isótopos que proporcionan la diferenciación de masa en el análisis espectrométrico de masas. Los químicos analíticos que usan GC-MS para su análisis a menudo “derivatizan” el analito y su analito marcado con isótopos estables (utilizado como patrón interno) en compuestos químicos que pueden pasar fácilmente a través de la columna GC o de lo contrario proporcionar mejores respuestas instrumentales. El análisis se convierte en el análisis del analito “derivatizado” y el estándar interno “derivatizado”, pero aún proporciona resultados comparativamente precisos de las concentraciones del analito mismo. Ejemplos de estos análisis se encuentran en las referencias citadas. Usando un razonamiento similar, uno puede sintetizar un derivado de isótopo estable del analito haciéndolo reaccionar con un reactivo marcado con isótopo estable. El compuesto químico marcado con isótopos resultante puede usarse como patrón interno en el análisis del analito, siempre que el analito en la muestra analizada se convierta en un compuesto químico de estructura idéntica a la del patrón interno usando un reactivo no marcado. Hay 3 requisitos para la utilidad de este método:

1. El analito en la muestra debe convertirse cuantitativamente en el compuesto de estructura idéntica (excepto los átomos marcados) como el del patrón interno marcado con isótopos agregado usando un reactivo no marcado. Absolutamente ninguna conversión del estándar interno marcado con isótopo al compuesto no marcado porque la conversión del analito ocurre en la muestra en presencia del estándar interno marcado con isótopo agregado.3. La conversión del analito en el compuesto de estructura idéntica a la del patrón interno marcado con isótopo agregado debe realizarse antes de realizar cualquier método de aislamiento, es decir, extracción.

Los dos primeros requisitos se relacionan con la química del analito en cuestión. La eficiencia de una reacción química elegida depende del tipo de reacción que, a su vez, depende del tipo de grupos funcionales del analito. Este método inventado se refiere al análisis de ácidos carboxílicos cuya química se centra en la reactividad de los grupos funcionales carboxilo del analito.

Las reacciones cuantitativas de los ácidos carboxílicos en muestras acuosas son:

1. Conversión a un éster usando un cloroformiato y un alcohol.2. Conversión a un éster usando un haluro de alquilo en condiciones alcalinas.

Existen otras reacciones de los ácidos carboxílicos que son muy eficientes, pero las reacciones de conversión anteriores son muy eficientes en un entorno acuoso y pueden realizarse a temperatura ambiente y en un tiempo de reacción relativamente corto. Estas son características necesarias y prácticas para el análisis rutinario de ácidos carboxílicos en muestras acuosas.

Breve resumen de la invención

La presente invención proporciona un método de identificación y cuantificación de ácido carboxílico en una muestra por espectrometría de masas con dilución isotópica. El estándar interno marcado con isótopos estables de dicho ácido carboxílico se sintetiza previamente haciendo reaccionar una muestra que contiene dicho ácido carboxílico analizado con un reactivo marcado. Después de este paso, dicho estándar interno marcado con isótopos estables se agrega a dicha muestra que contiene dicho ácido carboxílico analizado. Dicho ácido carboxílico analizado se convierte luego en un análogo no marcado de dicho patrón interno marcado con estructura química idéntica a dicho patrón interno marcado excepto para los átomos de isótopos estables usando un reactivo no marcado. Ambos, dicho ácido carboxílico convertido y su correspondiente patrón interno marcado con isótopos estables, se extraen y analizan por espectrometría de masas. Dicho estándar interno marcado con isótopos estables proporcionado en la presente invención son análogos de éster de ácido carboxílico marcado de dicho ácido carboxílico analizado. Hay 2 métodos para convertir cuantitativamente un ácido carboxílico en ésteres de ácido carboxílico en condiciones acuosas. Un método requiere un cloroformiato para activar el ácido para formar un éster activado intermedio que reacciona con un alcohol agregado para formar el éster de ácido carboxílico deseado. El otro método requiere una fuerte condición alcalina para que el ácido carboxílico reaccione con un haluro de alquilo añadido para formar el éster de ácido carboxílico deseado.

En comparación con el método tradicional de análisis espectrométrico de masas por dilución isotópica de más de un ácido carboxílico, el método inventado ofrece las siguientes ventajas:

1. La eficiencia y la simplicidad de las reacciones anteriores hacen posible la síntesis corta, confiable y rápida de patrones internos marcados con isótopos estables individuales, mientras que en el método tradicional de análisis, el patrón interno marcado con isótopos estables de cada ácido carboxílico tiene que sintetizarse independientemente .2. Es posible sintetizar rápida y eficientemente una biblioteca de patrones internos de isótopos estables para el análisis de una biblioteca completa de ácidos carboxílicos utilizando estas reacciones y solo un reactivo marcado con isótopos estables disponible comercialmente. Debido a que la síntesis de un estándar interno marcado con isótopos estables en este método inventado es generalmente una síntesis de un solo paso, todo el proceso de síntesis y preparación de muestras se puede realizar de manera automatizada. El estándar interno se prepara en un solo paso, el exceso de reactivo isotópico se destruye o elimina y el estándar interno preparado se puede agregar directamente a las muestras sin purificación. Se agrega el reactivo no marcado y la muestra está lista para la extracción poco después.
Estas características atractivas hacen que el método sea adecuado para el análisis de alto rendimiento de ácidos carboxílicos por espectrometría de masas con dilución isotópica

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