Mycoplasma es una de las mayores amenazas para el cultivo celular, temida por la mayoría de los investigadores que realizan tales experimentos.
La contaminación por micoplasma es relativamente común y puede persistir durante mucho tiempo sin ser detectada. Típicamente, un cultivo infectado puede extenderse a otros cultivos cuando se utilizan técnicas de trabajo inadecuadas. Además de las medidas de seguridad adecuadas (poner nuevas líneas celulares en cuarentenas, desinfectar el banco de trabajo cuando se trabaja con diferentes líneas celulares, dividir en alícuotas de medios …) es bastante fácil analizar cultivos celulares para detectar la presencia de micoplasma mediante PCR.
Si bien los kits de prueba comerciales son bastante fáciles y rápidos, a menudo son demasiado caros para la mayoría de los laboratorios para las pruebas de rutina. Sin embargo, los kits comerciales son innecesarios, ya que se han publicado secuencias de cebadores para la detección de micoplasmas junto con protocolos de rutina.
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A continuación se muestra un protocolo que he derivado de Uphoff y Drexler
1,2
. Recomiendo hacer esta prueba de forma rutinaria cada pocas semanas y en cada cultivo nuevo para detectar contaminación. Si hay alguna duda, también puede comenzar a probar medios, sueros, etc.
Order Primers
Necesitará ordenar múltiples cebadores hacia adelante y hacia atrás para detectar múltiples especies de micoplasma.
Cebadores de avance
- Myco-5-1 CGCCTGAGTAGTACGTTCGC
- Myco-5-2 CGCCTGAGTAGTACGTACGC
- Myco-5-2 TGCCTGAGTAGTACATTCGC
- Myco-5-2 TGCCTGGGTAGTACATTCGC
- Myco-5-5 CGCCTGGGTAGTACATTCGC
- Myco-5-6 CGCCTGAGTAGTATGCTCGC
Cebadores inversos
- Myco-3-1 GCGGTGTGTACAAGACCCGA
- Myco-3-2 GCGGTGTGTACAAAACCCGA
- Myco-3-3 GCGGTGTGTACAAACCCCGA
Prepare la mezcla de imprimación
Disuelva cada cebador a una concentración final de 100 µM. Mezcle todos los cebadores directos para alcanzar una concentración final de 10 µM cada uno. Por ejemplo, si desea preparar 100 µl de mezcla de imprimación, tome 10 µl de cada imprimación directa y agregue 40 µl de agua. Mezcle todos los cebadores inversos de manera similar.
Preparar muestra
Tome 100 µl de sobrenadante de cultivo celular de un cultivo denso (80-100% confluente) en un tubo de 1.5 ml (o medio, suero, lo que quiera probar). Calentar la muestra durante 5 minutos a 95 ° C (para desnaturalizarla) y girarla durante 2 minutos en una centrífuga de banco a la velocidad máxima.
Configurar PCR
Prepare la mezcla de reacción de PCR utilizando la siguiente tabla (puede necesitar algunos ajustes según el fabricante). Recuerde incluir una muestra de control negativo con agua para excluir falsos positivos y un control positivo si tiene uno (si identifica un cultivo infectado, también puede usar este sobrenadante como control positivo).
