La PCR en tiempo real es una técnica molecular basada en la reacción en cadena de la polimerasa. El qPCR permite controlar la amplificación de la molécula de ADN objetivo durante el paso de amplificación, en tiempo real, proporcionando al investigador un análisis cuantitativo. En la PCR en tiempo real, la cantidad de ADN se mide después de cada ciclo mediante tintes fluorescentes y la intensidad de la señal fluorescente depende del número de moléculas de producto de PCR (amplicones) generadas.
La reacción de PCR en tiempo real se compone de tres pasos principales que conforman cada ciclo. Las reacciones generalmente se ejecutan durante 40 ciclos.
1. Desnaturalización: la incubación a alta temperatura se utiliza para “fundir” el ADN bicatenario en cadenas simples y aflojar la estructura secundaria en el ADN monocatenario. Normalmente se usa la temperatura más alta que puede soportar la ADN polimerasa (generalmente 95 ° C). El tiempo de desnaturalización también depende del contenido de CG y al modularlo, es posible aumentar o disminuir la Tm (temperatura de fusión).
- ¿Pueden los ribosomas traducir secuencias de ADN directamente en un polipéptido, por ejemplo, en condiciones de laboratorio?
- ¿Cuáles son algunos compuestos con la misma fórmula molecular pero que tienen estructuras diferentes?
- ¿Es sorprendente que los genes predichos de humanos y ratones sean aproximadamente los mismos?
- ¿Qué significa cuando una cadena de ADN es complementaria?
- ¿Pueden los niveles crecientes de dopamina cambiar la relación del receptor D2 / D1 en la corteza prefrontal?
2. Recocido: durante el recocido, las secuencias complementarias pueden hibridarse, por lo que se utiliza una temperatura adecuada que se basa en la temperatura de fusión calculada (T m) de los cebadores (5 ° C por debajo de la Tm del cebador).
3. Extensión: a 70-72 ° C, la actividad de la ADN polimerasa es óptima, y la extensión del cebador se produce a velocidades de hasta 100 bases por segundo.
Por lo general, un dispositivo de PCR en tiempo real está hecho de un termociclador donde se inserta una placa de 96 pozos sellada con una capa de plástico transparente y un módulo óptico a través de haces de energía puede excitar el fluorocromo que se encuentra en los tubos de reacción de la placa, de modo que el SYBR Green emitirá fluorescencia que eventualmente será leída por el módulo óptico. La fluorescencia se lee y las señales se convierten en información analizada y graficada como fluorescencia frente al número de ciclo. El instrumento de PCR en tiempo real genera un gráfico de amplificación que representa la acumulación de producto durante la duración de la reacción de PCR completa.
Este es el esquema de una PCR en tiempo real que emplea sondas Taq Man
Así es como se traza en el software
